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細菌耐藥基因blaNDM常見亞型的環介導等溫擴增檢測技術
2020-06-24
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返回列表本標準規定了細菌耐藥基因blaNDM常見亞型(blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9)的環介導等溫擴增LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)檢測技術的操作步驟。
規范性引用文件：
《GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法》、《GB/T 16489 水質 硫化物的測定 亞甲基藍分光光度法》。
試驗原理
本標準所應用的試驗原理為：根據序列保守區域設計一對外引物、一對內引物和一對環引物特異性識別靶序列上六個獨立區域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物焦磷酸鎂白色沉淀產生，可以實現恒溫擴增和快速檢測，結果通過肉眼即可判定。
儀器設備
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低溫高速離心機：離心力20 000 g。
3、電熱恒溫水浴鍋。
4、穩流穩壓電泳儀。
5、水平電泳槽。
6、凝膠成像系統。
7、電子分析天平：精度0.001 g。
樣品
在生物安全柜中，將采集的樣品(如人或動物的肛拭子、鼻拭子或肝臟、脾 臟、腦等不同臟器組織等)無菌劃線特異性篩選培養基或哥倫比亞血瓊脂培養基，置37 ℃培養箱過夜培養12 h～18 h，獲得細菌單菌落，經二次純化后，挑取單菌落于BHI營養肉湯中過夜培養12 h～18 h，用于提取細菌基因組DNA。
DNA的提取
規范性引用文件：
《GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法》、《GB/T 16489 水質 硫化物的測定 亞甲基藍分光光度法》。
試驗原理
本標準所應用的試驗原理為：根據序列保守區域設計一對外引物、一對內引物和一對環引物特異性識別靶序列上六個獨立區域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物焦磷酸鎂白色沉淀產生，可以實現恒溫擴增和快速檢測，結果通過肉眼即可判定。
儀器設備
1、微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。
2、低溫高速離心機：離心力20 000 g。
3、電熱恒溫水浴鍋。
4、穩流穩壓電泳儀。
5、水平電泳槽。
6、凝膠成像系統。
7、電子分析天平：精度0.001 g。
樣品
在生物安全柜中，將采集的樣品(如人或動物的肛拭子、鼻拭子或肝臟、脾 臟、腦等不同臟器組織等)無菌劃線特異性篩選培養基或哥倫比亞血瓊脂培養基，置37 ℃培養箱過夜培養12 h～18 h，獲得細菌單菌落，經二次純化后，挑取單菌落于BHI營養肉湯中過夜培養12 h～18 h，用于提取細菌基因組DNA。
DNA的提取
收集過夜培養的待檢細菌菌液1 mL(菌液濃度的OD600值大于1.0)到1.5 mL的EP管中，12 000 g離心2 min，徹底棄上清，取沉淀用商品化的細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組總DNA，最后溶于50 μL滅菌水中，測定DNA的濃度，-20 ℃保存備用。
電泳及結果判定
保持穩定電壓80 V，電泳20 min，電泳反應結束后，在陽性和陰性對照成立的情況下，出現瀑布樣條帶的泳道判為陽性，說明待測樣品中含有超級細菌blaNDM基因(參見附錄B：圖1B泳道1和3)，不出現瀑布樣條帶的為陰性
